マイナポイントは悪質な詐欺まがい？

 

　マイナンバーカードを作成して何か私に便利、有利な点があるとは信じておらず、ずっと作らずに来た。昨年仕事を引退し、これを契機にマイナンバーカードをスマホ経由で作成してみた。知らない者には非常にわかりにくい、アプリを携帯に落とし、カードの申請を行った。携帯経由で写真まで送付したので、出来上がったカードが郵送されてくるのかと期待していたが、予約を入れて、直接区役所まで取りに行く必要があった。区役所までバスの往復で１時間余り。政府の役人は、国民の時間を浪費することには頓着する気もないようだ。マイナポイントを5000円分貰えるとテレビ等で盛んに宣伝してマイナンバーカードを作らせようとしているので、この機に、マイナポイントも申し込んでみた。マイナンバーカードの申し込みとはまた別のアプリを携帯に落とし、マナカでポイントを受け取ろうとした。すると、別途マナカのアプリを落とす必要があった。2時間ほど悪戦苦闘して、何をどうすれば良いのか全く分からず、諦めてソファーに横になっていたところ、家内が来て、再度試み始め、二人で更に2時間程掛って何とか最後まで到達した。翌日、ポイントがマナカに入っていることを確認するために、地下鉄の駅に行き、チャージ機に通してみたところ、全くポイントが付与されていなかった。

　何故か。再度アプリ上であちこち探してようやく見つけた。マイナカードへのポイントの付与は、新たに２万円をチャージしたのち初めてポイントが付与されるとあった。更に、ポイントの付与は、セブン銀行のATMで行う必要があった。テレビ等での宣伝の内容とは随分異なる。少なくとも２万円使わなければポイントが付与されないとは全く聞いたことがない。都合の悪いことを隠す、あるいは、すぐ見えないように、理解できないように、小さい文字で長々と記述する、前面に見えないようにページを変えるなど、姑息なやり方であり、国と名古屋市が共謀して行っている詐欺行為ではないかと考える。

　5000ポイントに対して２万円使用することを求めることからして、２万ポイントに対しては、８万円を使うことが求められているのだろうか。政府は姑息な宣伝ではなく、明確な説明をすべきである。本来、明確な説明をして、国民が納得すれば、ポイントなど不要である。

G2. 培養細胞からの核抽出画分の調整

2.　培養細胞からの核抽出画分の調整

Preparation of Nuclear Extracts from Cultured Cells (3 x 100mm dishes)

ここでは100 mmの培養皿3枚にconfluentになるまで培養した細胞からの核抽出画分の調整を延べる。総ての操作は低温で行う。

細胞は薄く撒いてconfluentになるのを待つのではなく、2-3日に一度は開きなおして丁寧に培養すれば、生きの良い綺麗な細胞からの核抽出物を得ることが出来る。

必要な器具：Rubber Policeman、Falcon round bottom high-clarity polypropylene tube with snap cap、高速冷却遠心機（卓上でも良いが固定ローターの方がペレットが斜めに落ちるのでbufferの除去操作が容易）、卓上超遠心機

Buffer:

buffer A: 10 mM   HEPES (7.9)                　buffer C:    20 mM      HEPES (7.9)

            1.5 mM      MgCl                                                   1.5 mM    MgCl

            0.5 mM      DTT                                                      0.5 mM   DTT

            0.5 mM      EDTA                                                   0.5 mM    EDTA

            1.0 mM      PMSF                                                    420 mM  NaCl

                                                                                               20 %     glycerol

                                                                                              1.0 mM  PMSF, 

                                                                                                             aprotinin, leupeptin, pepstatin

                                                                                  　　　　　　　 (これらは適当濃度）

1.       3枚のプレートから培養液を吸引除去し、2 ml/plateのPBSを加え、rubber policemanで細胞を搔き取り、3枚分を1本の14 mlのFalconのチューブに移す。6000 rpm x 2 min 遠心分離して、上澄みを吸引除去する（ペレットのある方を下にチューブを斜めにして、ペレットを吸い込まないように注意する）。

2.       3 mlのbf Aを加えてピペッッターで分散し、これを5 mlの超遠心チューブ (5 ml thick wall polycarbonate, Tabletop Ultracentrifuge TL100) に移し、10,000 rpm x 2 min超遠心分離する。

3.       上澄みを除き、超遠心チューブの中でペレットと同量のbf C（目分量でペレットと同じ程度の体積） にピペットで分散し、65,000 rpm x 10 min で超遠心する。

4.       上澄み（核抽出画分）を1.5 mlのチューブに移し、一部は蛋白定量に回す。タンパク質として、約2-5 mg/ml あれば問題ない。核抽出画分は液体窒素で凍結して、超低温冷凍機（-70 ℃）で保存する。

注）

A)      注意点は組織からの抽出とほぼ同様である。特に細胞からの場合は、3のステップでbf Cを増やしすぎないことが重要で、Gel Shift Assay (Gel Retardation Assay) に使用するのみであれば、10-20 microL もあれば十分である。

B)      この方法で得た核抽出画分は、毎回液体窒素で凍結する限り、何回も溶かして使用することが出来る。

G1. 組織からの核抽出画分の調整

1.　組織からの核抽出画分の調整

Preparation of Nuclear Extracts from Tissues

ここでは、組織から少量の核抽出画分を調整する方法を述べる。尚、以下の操作は基本的に総て氷上で行う。
基本的な考え方は、ある程度組織をばらしてPBSで組織を洗った後、余計な部分を除いてほぼ細胞レベルに近い程度まで分散して、イオン強度を下げた低張液で浸透圧と機械的な分散により細胞膜を破る。これにより細胞質の成分を低張液中に溶出させて出来るだけ除き、次にイオン強度の高いバッファーでionicに結合している核抽出物を溶出させて回収する。
当然、細胞壁を持つ酵母、植物系の細胞や組織に対しては、予め細胞壁を処理しておく必要がある。

機器：ハサミ、Dounce Glass Tissue Homoginizer (Wheaton) 容量40 ml、Stainless Spatula（小）、高速冷却遠心機（卓上でも良いが固定ローターの方が操作が容易）、卓上超遠心機

Buffer:

buffer A: 10 mM    HEPES (7.9)                　buffer C:    20  mM     HEPES (7.9)

               1.5 mM    MgCl                                                  1.5 mM    MgCl

               0.5 mM    DTT                                                    0.5 mM    DTT

               0.5 mM    EDTA                                                 0.5 mM    EDTA

               1.0 mM    PMSF                                                420 mM    NaCl

                                                                                             20 %       glycerol

                                                                                            1.0 mM   PMSF,

                                                                                            aprotinin, leupeptin, pepstatin

1.        1-2 cm角程度の体積の組織をハサミで小さく刻みながら適量のPBSを入れたガラスホモジナイザー 内に落とす。

2.        粗くホモジナイズする。組織を押しつぶしながら、邪魔になる筋などはspatulaで取り除く。

3.        遠心tubeに移して軽くスピンダウンする。

4.        目分量でペレットの5 volのbuffer Aで分散しながら、ガラスホモジナイザーに移し、ガラスの心棒を回しながら10-15 回上下して全体がほぼ均一に分散した状態とする。

5.        遠心tubeに移し、spin down (6000 rpm x 2 min)。

6.        上澄みを除き、2-3 volのbuffer Aでペレットを分散し、ガラスホモジナイザーに移して、ガラスの心棒を回しながら10-15 回上下して全体をほぼ均一に分散。

7.        遠心tubeに移し、spin down (6000 rpm x 2 min)した後、上澄みをできるだけ丁寧に除く。（disposableのガラスピペットを用いてアスピレーションで余分な上澄みを除く。この際、angle rotor を使用した方がペレットが斜めになり上澄みを除きやすい。）

8.        1 volのbuffer C（1-2 ml程度になる）を加えてペレットを分散しガラスホモジナイザーに移し、ガラスの心棒を回しながら数回上下する。

9.        懸濁液を超遠心tubeに移し、超遠心（65000 rpm x 10 min）。（もし、卓上超遠心が使用できる環境に無い場合は、床置の高速遠心機で10000 rpm x 10 minでも良い。）

10.     上澄み（clearな部分のみ）を1.5 mlの保存用tubeに移し、一部は蛋白定量に回す（蛋白濃度はおよそ2−5mg/mlであれば良い）。Tubeは液体窒素で凍らせ、-70℃で保存する。

注）

A)      最終的な核抽出画分のタンパク質濃度は1 mg/ml以上であることが望ましい。これ以下の濃度になると容易に懸濁物が生じて核酸への結合能が失われることがある。

B)      多くのプロトコールでは、buffer Cでの抽出液を透析して塩濃度を下げるステップが含まれているが、透析をするとタンパク質が凝集して懸濁物が生じやすく、必要な成分（核タンパク質）が失われる。従って、透析はすべきではなく、又、そのままで続くGel Retardation Assay (gel shift assay) に重要な影響を与えることは無い。

小保方博士とSTAP細胞

小保方博士を筆頭著者とする論文にデータの捏造が有ったと理研が公表し、小保方博士はミスであったと主張している。

論文を発表する段階で、データの取り違えをすることは、少なくとも小保方博士が論文を書いたのであれば、データの取り違えなどあり得ないことであり、捏造以外の解釈はあり得ない。一方で、総ての共著者は、捏造の共犯であり、責任逃れに終始することは、みっともないばかりでなく、研究者としての倫理観の欠如とも言える。

筆頭著者が、データのすり替えを行おうと試みたとしても、正常な研究の進め方をしていれば、論文執筆の前に共著者の間でデータの公表と批判が有り、研究データにチェックが入り、一人で捏造などは容易にできるものではない。

このような、複数の研究者を採用した理研および大学の選考委員会のメンバーもまた責任を取ってしかるべきである。

STAP細胞を他の研究者が再現できなかったとしても、それが直ちに無かったことにはならない。唯一の明快な証明は、公開実験にて小保方博士が再現してみせることができるかどうかである。その点で、理研の云う第三者による再現というのは、研究者らしからぬ発想であり、意味が無い。理研の幹部の良識を疑う。

プラスミド ラージプレップ（Plasmid large preparation）CsCl法

　遺伝子の発現調節などを調べる為にtransfectionを行うような場合には、数種のプラスミドを大量に必要とする場合が多い。あるいは、頻繁に使用する一般的なベクター、pET、pBSなどは、一度に確保しておけば常に安定した結果を得ることができる。このような場合には、CsCl法が有利である。

　使用機器：

Sorval 又はBeckman冷却高速遠心機（polypropylene 38ml tube 6本以上を回せるローター）

Beckman 卓上超遠心機　（ローターTL100.4) ：　ベックマンの卓上超遠心機・ローターは順次モデルが新しくなっており、新しいローターではTLA-110に相当する。TubeはQuickSealの5.1 ml（新しい4.7 mlのタイプを私は使用したことが無い）。

　　CsCl法の前半のplasmidの抽出は、mini prepとほぼ同様である。以下に示すプロトコールは、一般的なものであり、Ethidium Bromide（EtBr）が吸着したsupercoilのplasmidの比重がrelaxed plasmidやlinear DNAより大きいことを利用している。

　遠心後のtubeの様子を簡単に示すと、CsClの水溶液は、超遠心によりgradientを形成するので、比重差によりsuper coil plasmidを左図のように超遠心tubeの中心付近に分離することが出来る。Tubeの下部はRNAにより強く光る。上部には、タンパク質その他のjunkが浮遊する。中央付近に来る2本のバンドの内、下の太いものだけを取り出す。

　EtBrの蛍光を見るので、可視化する為にはUV照射が必要である。従って、UVが直接眼に当たることが無いように十分な注意が必要である。

　又、EtBrは強い変異原性を持つので、使用には手袋を着用し、廃液の処理も十分な注意が必要である。EtBrの廃液の処理には、活性炭濾過キットなどが売られている。

　取り出し方は、1 mlの注射器と注射針を用意し、下のバンドより少し下に注射針を通す。針の穴を上向きにして、バンドの下部に当たるようにしてゆっくりと吸い出せば、きれいに吸い出すことができる。この時に、吸い出すvolumeは少ない程後の処理が容易となる。

注1）操作の1-10までは基本的にmini prepとほぼ同じであり、操作3で大腸菌の固まりが残らないように完全に分散すること、操作5では、NaOH/SDSで溶液が完全にクリアになり大腸菌の濁りが残らないこと、操作6では、透明のゼリー状の部分が残らないように、ピペットなどで押しつぶしながら、総てが白いjunkとサラサラの液体と成るまで静かに混ぜることに注意する。

注2）操作11の後、遠心tubeを手折るペーパーの上にひっくり返して静置し、残った液体部分を完全に除く。（plasmidのペレットが動くようであれば、ひっくり返すことはあきらめて、ピペットで残りの液を吸い取る。

注3）操作12は2 mlの水に丁寧にペレットを溶かす。その後、操作13で2.6 gのCsClを加えて良く溶かす。この時点で、全体のvolumeは2.6 mlとなる。つまり、最終的に加えた水の約1.3倍の体積となる。

注4）EtBrを加えると大量のjunkが出る。これは特に小volumeの遠心tubeを用いる場合には、遠心後plasmidを回収する時に邪魔になるので、操作15で簡単に室温で遠心してjunkを除いておく。

注5）操作16-17で、junkを除いた液を超遠心tubeに移し、出来るだけ上部の空間を残さないように、CsCl/EtBr水溶液で満たした後、tubeをシールする。熱シールを使う場合、空のtubeを使って一度練習しておくのが良い。

注6）サンプルが奇数となった時は、同じCsCl/EtBr水溶液でバランス用のtubeを作っておく。これは超遠心後に、注射器でplasmidのバンドを採取する時の練習用として使う。注射針を刺す時の加減、plasmidを採取した後、CsCl/EtBrの溶液の入った側壁に穴の空いたtubeの扱いなど、予め考えて練習しておく方が賢明である。

注7）操作19で0.1-0.2 mlとなるようにplasmidのバンドを取り出す。この体積を小さくしておけば、以後の処理を1.5 mlのtube一つで処理できる。操作20-23は、例えば、plasmid溶液が0.2 mlとなったとすると、0.2 mlの水を加え、水で飽和したn-butanolを1 ml加えて、ボルテックス／遠心を繰り返して、plasmid液のEtBrを完全に除く。

注8）操作24では、最初に採取したvolumeが多めの場合には、CsClの沈殿が出るが、気にせずspin downし、CsClの沈殿が出なくなるまで、操作26を繰り返す。

注9）このプロトコールは基本的に、扱うvolumeを小さくしているので、RNAの混入は増える傾向に有る。これを除き、更に余計な不純物を除く為には、0.4 mlの水にペレットを溶かした後、mini-prepで述べたDNAse free-RNAse処理の後、PEG/NaCl溶液（20% PEG 8000/2.5 M NaCl）を0.24 ml加えて、spin downし、EtOH Washの後、0.2 mlの水に溶かし、7.5 M NH₄AcO溶液を0.1 ml加えてspin downして、上澄みを新しい1.5 ml tubeに移して、0.6 mlのEtOHを加えてspin down、EtOH washの後、0.05-0.1 mlの水に溶かす。EtOH washの目的は、塩を除くことにあるので、いずれの場合にもボルテックスなどはせず静かに加えて、そのままspin downする。

　

CsCl Plasmid Preparation

1.   O/N culture in 200 ml TB.

2.   Spin down (3000g, 10min).

3.   Suspend in 2 ml Lysis bf. (1mg lysozyme).

4.   Inc. room temp. for 10 min.

5.   Add 4 ml SDS-NaOH sol., gently mix until E. coli is lysed, and place on ice. (Solution will be yellow and viscous.)

6.   Add 3 ml 3M KAcO (pH4.2), gently mix and keep it on ice. (Yellow and viscous solution will disappear.)

7.   Spin down (10,000g, 10min) at 4^oC.

8.   Transfer sup. into a new tube.

9.   Add 0.6 vol isopropanol and mix.

10.  Spin (10,000g, 10min).

11.  Discard sup. and remove the trace of sup completely.

12.  Dissolve pellet in 2 ml water.

13.  Add and dissolve 2.6 g CsCl.

14.  Add 210 ml ethidium bromide (10mg/ml in water). (Caution: Ethidium bromide is a powerful mutagen.)

     (80 ml ethidium bromide for 1 ml CsCl-DNA solution)

15.  Spin for 10min (10,000g).

16.  Transfer sup. into a heat seal centrifugation tube.

17.  Fill the tube with CsCl-ethidium bromide (1 ml water: 1.1g CsCl: 105 ml ethidium bromide) solution.

18. Centrifuge at 75,000 rpm (TL100.4) O/N at 20^oC.

19.  Isolate and transfer (into 1.5 ml tube) the visible plasmid band from side using needle. (The isolated volume will be 100-200 ml.)

20.  Add 1 vol water and 1 ml n-butanol.

21.  Vortex, spin for 1 min, and discard upper phase.

22.  Repeat the extraction of ethidium bromide until all the pink color disappears.

23.  Adjust the volume to 400 ml by adding water.

24. Add 20 ml NaAcO and 1 ml Ethanol.

25.  Spin for 10min and discard sup.

26   Dissolve the pellet in 400 ml water, and add 40 ml NaAcO and 1 ml EtOH.

27.  Repeat 26.

28.  Wash the pellet with 75% EtOH (spin).

29.  Remove EtOH completely by pipetting.

30. Dissolve the pellet in 50-100 ml water.

Lysozyme bf.

       25 mM Tris-HCl (pH8.0)

       10 mM EDTA

       50 mM  Glucose

SDS-NaOH sol.

       0.5 g  SDS

       0.4 g  NaOH

5 M KAcO (pH5.2) (refere to Molecular Cloning)

10 mg/ml             ethidium bromide (in water)

3 M NaAcO (pH5.2)