プラスミド ラージプレップ（Plasmid large preparation）CsCl法

　遺伝子の発現調節などを調べる為にtransfectionを行うような場合には、数種のプラスミドを大量に必要とする場合が多い。あるいは、頻繁に使用する一般的なベクター、pET、pBSなどは、一度に確保しておけば常に安定した結果を得ることができる。このような場合には、CsCl法が有利である。

　使用機器：

Sorval 又はBeckman冷却高速遠心機（polypropylene 38ml tube 6本以上を回せるローター）

Beckman 卓上超遠心機　（ローターTL100.4) ：　ベックマンの卓上超遠心機・ローターは順次モデルが新しくなっており、新しいローターではTLA-110に相当する。TubeはQuickSealの5.1 ml（新しい4.7 mlのタイプを私は使用したことが無い）。

　　CsCl法の前半のplasmidの抽出は、mini prepとほぼ同様である。以下に示すプロトコールは、一般的なものであり、Ethidium Bromide（EtBr）が吸着したsupercoilのplasmidの比重がrelaxed plasmidやlinear DNAより大きいことを利用している。

　遠心後のtubeの様子を簡単に示すと、CsClの水溶液は、超遠心によりgradientを形成するので、比重差によりsuper coil plasmidを左図のように超遠心tubeの中心付近に分離することが出来る。Tubeの下部はRNAにより強く光る。上部には、タンパク質その他のjunkが浮遊する。中央付近に来る2本のバンドの内、下の太いものだけを取り出す。

　EtBrの蛍光を見るので、可視化する為にはUV照射が必要である。従って、UVが直接眼に当たることが無いように十分な注意が必要である。

　又、EtBrは強い変異原性を持つので、使用には手袋を着用し、廃液の処理も十分な注意が必要である。EtBrの廃液の処理には、活性炭濾過キットなどが売られている。

　取り出し方は、1 mlの注射器と注射針を用意し、下のバンドより少し下に注射針を通す。針の穴を上向きにして、バンドの下部に当たるようにしてゆっくりと吸い出せば、きれいに吸い出すことができる。この時に、吸い出すvolumeは少ない程後の処理が容易となる。

注1）操作の1-10までは基本的にmini prepとほぼ同じであり、操作3で大腸菌の固まりが残らないように完全に分散すること、操作5では、NaOH/SDSで溶液が完全にクリアになり大腸菌の濁りが残らないこと、操作6では、透明のゼリー状の部分が残らないように、ピペットなどで押しつぶしながら、総てが白いjunkとサラサラの液体と成るまで静かに混ぜることに注意する。

注2）操作11の後、遠心tubeを手折るペーパーの上にひっくり返して静置し、残った液体部分を完全に除く。（plasmidのペレットが動くようであれば、ひっくり返すことはあきらめて、ピペットで残りの液を吸い取る。

注3）操作12は2 mlの水に丁寧にペレットを溶かす。その後、操作13で2.6 gのCsClを加えて良く溶かす。この時点で、全体のvolumeは2.6 mlとなる。つまり、最終的に加えた水の約1.3倍の体積となる。

注4）EtBrを加えると大量のjunkが出る。これは特に小volumeの遠心tubeを用いる場合には、遠心後plasmidを回収する時に邪魔になるので、操作15で簡単に室温で遠心してjunkを除いておく。

注5）操作16-17で、junkを除いた液を超遠心tubeに移し、出来るだけ上部の空間を残さないように、CsCl/EtBr水溶液で満たした後、tubeをシールする。熱シールを使う場合、空のtubeを使って一度練習しておくのが良い。

注6）サンプルが奇数となった時は、同じCsCl/EtBr水溶液でバランス用のtubeを作っておく。これは超遠心後に、注射器でplasmidのバンドを採取する時の練習用として使う。注射針を刺す時の加減、plasmidを採取した後、CsCl/EtBrの溶液の入った側壁に穴の空いたtubeの扱いなど、予め考えて練習しておく方が賢明である。

注7）操作19で0.1-0.2 mlとなるようにplasmidのバンドを取り出す。この体積を小さくしておけば、以後の処理を1.5 mlのtube一つで処理できる。操作20-23は、例えば、plasmid溶液が0.2 mlとなったとすると、0.2 mlの水を加え、水で飽和したn-butanolを1 ml加えて、ボルテックス／遠心を繰り返して、plasmid液のEtBrを完全に除く。

注8）操作24では、最初に採取したvolumeが多めの場合には、CsClの沈殿が出るが、気にせずspin downし、CsClの沈殿が出なくなるまで、操作26を繰り返す。

注9）このプロトコールは基本的に、扱うvolumeを小さくしているので、RNAの混入は増える傾向に有る。これを除き、更に余計な不純物を除く為には、0.4 mlの水にペレットを溶かした後、mini-prepで述べたDNAse free-RNAse処理の後、PEG/NaCl溶液（20% PEG 8000/2.5 M NaCl）を0.24 ml加えて、spin downし、EtOH Washの後、0.2 mlの水に溶かし、7.5 M NH₄AcO溶液を0.1 ml加えてspin downして、上澄みを新しい1.5 ml tubeに移して、0.6 mlのEtOHを加えてspin down、EtOH washの後、0.05-0.1 mlの水に溶かす。EtOH washの目的は、塩を除くことにあるので、いずれの場合にもボルテックスなどはせず静かに加えて、そのままspin downする。

　

CsCl Plasmid Preparation

1.   O/N culture in 200 ml TB.

2.   Spin down (3000g, 10min).

3.   Suspend in 2 ml Lysis bf. (1mg lysozyme).

4.   Inc. room temp. for 10 min.

5.   Add 4 ml SDS-NaOH sol., gently mix until E. coli is lysed, and place on ice. (Solution will be yellow and viscous.)

6.   Add 3 ml 3M KAcO (pH4.2), gently mix and keep it on ice. (Yellow and viscous solution will disappear.)

7.   Spin down (10,000g, 10min) at 4^oC.

8.   Transfer sup. into a new tube.

9.   Add 0.6 vol isopropanol and mix.

10.  Spin (10,000g, 10min).

11.  Discard sup. and remove the trace of sup completely.

12.  Dissolve pellet in 2 ml water.

13.  Add and dissolve 2.6 g CsCl.

14.  Add 210 ml ethidium bromide (10mg/ml in water). (Caution: Ethidium bromide is a powerful mutagen.)

     (80 ml ethidium bromide for 1 ml CsCl-DNA solution)

15.  Spin for 10min (10,000g).

16.  Transfer sup. into a heat seal centrifugation tube.

17.  Fill the tube with CsCl-ethidium bromide (1 ml water: 1.1g CsCl: 105 ml ethidium bromide) solution.

18. Centrifuge at 75,000 rpm (TL100.4) O/N at 20^oC.

19.  Isolate and transfer (into 1.5 ml tube) the visible plasmid band from side using needle. (The isolated volume will be 100-200 ml.)

20.  Add 1 vol water and 1 ml n-butanol.

21.  Vortex, spin for 1 min, and discard upper phase.

22.  Repeat the extraction of ethidium bromide until all the pink color disappears.

23.  Adjust the volume to 400 ml by adding water.

24. Add 20 ml NaAcO and 1 ml Ethanol.

25.  Spin for 10min and discard sup.

26   Dissolve the pellet in 400 ml water, and add 40 ml NaAcO and 1 ml EtOH.

27.  Repeat 26.

28.  Wash the pellet with 75% EtOH (spin).

29.  Remove EtOH completely by pipetting.

30. Dissolve the pellet in 50-100 ml water.

Lysozyme bf.

       25 mM Tris-HCl (pH8.0)

       10 mM EDTA

       50 mM  Glucose

SDS-NaOH sol.

       0.5 g  SDS

       0.4 g  NaOH

5 M KAcO (pH5.2) (refere to Molecular Cloning)

10 mg/ml             ethidium bromide (in water)

3 M NaAcO (pH5.2)

グローバル化と英語教育

　多くの企業が、世界を相手に製品を輸出し、あるいは、世界各国で製造販売をする事が、企業が生き残る為の必然であるという。その為には、誰もが英語で話せるようになる事が必要であり、会社では公用語を英語としたり、学校でも小学校から英語教育を導入する必要があるらしい。

　日本人は英語の読み書きは出来るが、会話が出来ない。

　人は自分が聞きたいと思う言葉を容易に信じる。もっともらしく、なるほどと思う説明は、何ら根拠の無い嘘でも、容易に受け入れられ広く信じられ、世の常識にさえなってしまう。「日本人は英語の読み書きは出来るが会話は出来ない」というのは、「読み書きも、会話も出来ない」と言われるのに較べ、全否定でないだけ受け入れ易い。結果的に、誰が言ったのか知らないが、このような受け入れ易い嘘が、広く世の中に浸透した。

　私は、アメリカの大学で日本から来るポスドクの人たちを見ていて、最近の若い人たちは、かなり日常的な英会話がましな人が増えてきたと感じていた。「英会話が出来ない」部分はかなりましになりつつ有るというのが私の実感である。しかし、新しく来るポスドクの人たちの中で、出来ることになっている「英語の読み書きは出来る」という日本人は実は見た事が無い。ポスドクとしてアメリカの大学に所属すると、まず簡単な説明会が有り、雇用関係、税金、健康保険等についての説明を受け、書類を渡される。これらの書類を自分で読み理解できる人はほとんど居ないように感じていたものである。特に、日本では、組織に属していれば、税金も健康保険も、自分で選択して手続きをとる必要はほとんどなく、認識にもギャップが有る。

　日本人は、会話に加え、特に英語の読み書きが出来ない。英語の読み書きを教えることのできる教師が、中学校、高校にいないのであるから、これは当たり前の話である。英会話であれば、録音を聞かせてリピートすることもできるが、学生に長文を書かせて、それを直すことのできる教師は、中学、高校には皆無に等しいと行っても過言では有るまい。大学の教養でも、英語の教師は、英文学などの専門家であり、教材は文学関係となる。その結果、法学部の学生が専門分野の英語を身につける為には、自己学習となり、科学系の学生に取っても事情は同じである。ある程度の英語の読み書きを推進するならば、中学、高校、大学の英語の教材に、文学、社会、理科の3分野の内容を盛り込む事が必要である。現在の英語教育では、大学まで英語を学んでも、アメリカの小学生と算数の話も出来はしない。

原子力発電考4：電力不足→再稼働の図式

原子力発電再稼働の布石

　「福島の原子力発電の事故は悲惨なものであり2度と繰り返してはならないものである。従って、原子力発電の安全性には、厳しく対処すべきである。しかし、現に電力の安定供給が脅かされており、十分に安全性を確認した後であれば、原子力発電の再稼働もやむを得ないかもしれない。再稼働は仕方が無いが、安全性を厳しく検証しなければならない」というような論旨の記事やコメントを、最近、目にし、耳にする事が増えてきたように感じる。

　これは再稼働に反対のポーズを見せながら、再稼働やむなしとの雰囲気を作ろうとするものであり、巧妙な再稼働推進の意図を感じる。電力会社の国民に対する一種の洗脳、非常に多くの企業集団からなる原発産業の意志、日本政府の、アメリカ政府の意図でさえもあり得る。テレビをはじめとするジャーナリズムも、スポンサーに逆らえる程、公正中立ではあり得ない。

　もはや、アメリカにおいても、国内で新しく原子力発電所を建設する事は出来ない状況にあるが、海外には原子力発電プラントを輸出し、これまでの投資に対し、十分に見合う以上の利益を上げたいのであろう。この点は、日本政府と原発関連産業も同じ穴の狢である。

　しかし、福島において事故を起こし、現在においても、原子炉建屋は手つかずのままであり、汚染水の処理にも目処が無く、ただただ環境中に放射性化合物を拡散させている現状を内に抱えながら、一方で、日本の原子力発電技術は安全だとして海外にプラント輸出をしようと目論むのは、信義にもとる行為である。これは、現在親日的な国の人々の信頼を裏切る行為である。

電力不足を補うには再稼働も仕方が無い？

　電力が不足するから、安全性さえ厳しくチェックすれば、再稼働も仕方が無いというのは、ずいぶん物わかりの良い話である。常軌を逸した物わかりの良さというべきかもしれない。

　疑問点1：誰が電力が不足すると言っているのか。電力会社であり、それ以外ではない。

　

　疑問点2：誰が電力の需給をデーターに基づき予測、推定しているのか。電力会社である。

　つまり、電力不足は、原発再稼働を前提として電力会社各社が主張しているに過ぎず、真実がどうであるのか客観的に検証されてはいない。これは、泥棒に自らをしばる縄をなわせるに等しい。まずは、第3者委員会を設置し、電力需給状況の実態把握と、予測に対する対処法の検証を行い、妥当かつ可能な対処法の予測と提言を求めるべきである。当然ながら、この委員会には、電力会社関係者、原発産業関係者、これらから研究費を受けているような研究者、政府関係者は含まれるべきでない。

まず、電力の需給状況の精査と客観的予測
電力の供給を確保する方法として、原発の再稼働とその他の方法のリスクと経済性をも含めた客観的比較と妥当な選択
これらを、利害性を排除して検証した結果を知りたいものである。常に一方的な、都合の良い話ばかりではないものを知りたいものである。

原子力発電を廃炉にする能力が電力会社に有るのか否か

　現在、電力各社は、原子炉を自前で廃炉にする能力を持ち合わせているのだろうか。核燃料棒を取り出して、安全に、半永久的に保存する場所の用意は出来ているのか。既に積み重なっている使用済み核燃料もしかり。恐らく、何ら明確な目処は立っておらず、国まかせと考えるがどうであろうか。

　燃料棒を取り出した後の原子炉は、どのように処理する計画なのか。明確な廃炉行程が有るかどうかも疑わしい。原発に対する危惧は、電力会社には、自力で老朽化した原発を廃炉にする能力もないことである。事故が起これば、それに対処する技術も能力も無く、単に自ら停止した原子炉を廃炉とする能力も無い状態で、尚、再稼働を図る考えは、私には理解できない。原発は、ただ止めているだけでも莫大な保守管理の経費が掛かる事であり、電力各社の経営陣は気が気では無かろう。しかし、彼らは、原発に対して、万が一何かが起こった時の恐怖を感じない程に欲ボケしてしまっているのか。

放射性物質は誰にもどうにも出来ないだろう。

　放射性物質は、一旦環境中に放出されてしまえば、もはや誰にもどうすることもできない。通常の汚染化合物であれば、集めて焼却処理をすることができる。様々な産業廃棄物、生活廃棄物も何らかの方法で処理し、何とか安全な物へと形を変えることができる。しかし、放射性物質は、どのように形を変えようと、放射性物質であり、ただ集めて、可能であれば濃縮して、（人間の寿命からすれば）永久保存する以外の方法は無い。福島で生じている放射性物質の内でも、とりわけトリチウムは問題が多い。一旦、水分子となったトリチウムは、ただの水でありこれを分けて濃縮することは、少なくとも現実的な経済性の範囲では、できない。福島の汚染水の流出は、マスコミが騒ぐ以上に深刻な問題である。