大腸菌で発現したタンパク質の精製6：DEAE Sepharose 使用の具体例

大腸菌で発現したP450c21はNi-NTA agaroseで精製後、DEAE Sepharoseを素通りさせ、それを更にSP Sepharoseで精製する。ここでは、DEAE Sepharoseを素通りさせる過程を具体的に示す。

必要なバッファー：

Buffer E:

20% Glycerol

0.1 mM DTT

0.1 mM EDTA

1.5% NaCholate

1% Tween 20

0.1 mM PMSF

Buffer F:

 20 mM KPi (7.4)

20% Glycerol

0.1 mM DTT

0.1 mM EDTA

1.0% NaCholate

0.1% Tween 20

0.1 mM PMSF

Buffer G:

50 mM KPi (7.4)

20% Glycerol

0.1 mM DTT

0.1 mM EDTA

1% NaCholate

0.5%    Tween 20

0.1 mM PMSF

20 mM imidazole

Buffer H:

60 mM Imidazole-AcO (7.4)

20% Glycerol

0.1 mM DTT

0.1 mM EDTA

1% NaCholate

0.5%    Tween 20

0.1 mM PMSF

樹脂はDEAE Sepharose (Fast flow)を内径2.7 cmのカラムに5-6 cmの高さとなるように、buffer Fで平衡化して詰める。

１）Ni columnからの溶出画分を、同じvolumeのbuffer Eで希釈する。(この段階では、イミダゾールがヘム鉄に配位しているので、うかつに透析でイミダゾールを除くと総て沈殿して発現からやり直すことになる）

２）希釈したP450を含む溶液を樹脂を乱さないようにカラムに加える。この時の流速は5-6秒に1滴とする。総ての溶液を加えて樹脂を素通りさせる。

３）ほぼ総ての溶液が樹脂に吸収され、上部に樹脂の上部に1-2 mmとなった時点で、buffer Gを2-3 mlそっと加え、これが樹脂に吸収するのを待ち、もう一度、2-3 mlのbuffer Gを加えてこれが樹脂に吸収されるのを待ち、10-20 mlのbuffer Gで押し出した後、40 mlのbuffer Hで残りを出し切る。

４）適当なフラクションをピックアップして、CO-スペルトルを測定し、回収する画分を決める。

５）回収したフラクションは、一部電気泳動用に分けておき、総てを液体窒素で凍らせて、-80度で保存する。

注）コール酸はDEAE Sepharoseに吸着する。このために、一部P450は軽くカラムに吸着するが、buffer Hで溶出される。