大腸菌でタンパク質を発現する法23：発現ベクターの作成1

発現ベクターの作成も、小さなことを知らないと徒に時間を浪費することになる。ここでは、既にcDNAを含むプラスミドを入手できている状態から解説する。

手順としては、

１）PCRによるインサートの合成（N-末はNdeI、仮にC-末はHindIIIとする）。

２）PCR産物（cDNA）をミニゲルから単離精製。

３）精製したcDNAをpUCまたはpBluescript（pBS）に挿入。

４）インサートの入ったpUCまたはpBSをminiprepで単離し、インサートのDNA配列を完全に確認する。

５）インサートをNdeI/HindIIIで切り出し、pETに挿入し、DH5など、T7 RNA polymeraseを持たないホストに導入する。

６）transformantからプラスミドを単離し、NdeI/HindIIIで切って、インサートが切り出されることを確認出来たプラスミドを、発現ベクターとして採用する。

７）この発現ベクターをBL21系のホストに導入し、ポジティブクローンを発現用の大腸菌として、１mlの一夜培養を行う。

８）一夜培養液を用いて、大腸菌でタンパク質を発現する法8に従って、IPTG screeningを行う。この方法により、誘導時のIPTG濃度を決めるというのは、実はもっともらしい嘘である。

９）IPTG screeningにより選択したクローンを用いて発現の実験を行う。誘導時のIPTG濃度は、通常0.5 mMを用いることができる。

次回分からは、上記の手順に従って、発現ベクターの作成について詳細を説明する。

大腸菌で発現したタンパク質の精製8：ヒドロキシアパタイトの例

　大部分の哺乳動物のP450はヒドロキシアパタイトでの精製が可能である。ヒドロキシアパタイトは、DEAE-, CM-Sepharoseなどとは性質が異なるので、これらのカラムの後に使用することができる。相対的に吸着容量が小さいこと、粒径が小さいものが一般的で、樹脂の粒がもろいため壊れ易く、カラムが詰まり易いなど、慣れないと扱いにくい面がある。

　Bio-Radのものが一般的で、最近では、樹脂がくだけ易い性質を改良したセラミック担体のものが普通のようである。

　ここでは、大腸菌で発現したアロマテースを、Ni-agarose、DEAE-Sepharoseで精製した後の、3番目のカラムとして用いる例を示す。

DEAE-Sepharoseで素通りしたaromataseサンプルのbuffer組成：

Buffer E:

90 mM        KPi (7.4)

20%             Glycerol

0.1 mM       DTT

0.1 mM       EDTA

1.0%            NaCholate

1.0%            Tween 20

1.0%            Emulgen 913

Hydroxyapatite column (内径2.7 cm x 5-6 cm)

必要なbuffer:

Buffer F:　

20%            Glycerol

0.1 mM       DTT

0.1 mM       EDTA

1.0%            NaCholate

1.0%            Tween 20

0.1 mM       PMSF

Buffer G:

20 mM        KPi (7.4)

20%             Glycerol

0.1 mM       DTT

0.1 mM       EDTA

1.0%            NaCholate

1.0%            Tween 20

0.1 mM       PMSF

Buffer H:

30 mM        KPi (7.4)

20%             Glycerol

0.1 mM       DTT

0.1 mM       EDTA

1.0%            NaCholate

1.0%            Tween 20

0.1 mM       PMSF

Buffer I:

125 mM      KPi (7.4)

100 mM      NaCl

20%             Glycerol

0.1 mM       DTT

0.1 mM       EDTA

1.0%            NaCholate

1.0%            Tween 20

0.1 mM       PMSF

１）上記DEAE-Sepharoseからの素通り画分を、3 volumeのBuffer Fで希釈する。

２）これを、予めBuffer Gで平衡化したHydroxyapatiteに通す。

３）カラムを10-15 mlのBuffer Gで洗浄する（5-6秒に1滴）。

４）10-15 mlのBufer Hで洗浄する（5-6秒に1滴）。

５）Buffer Iで溶出する（12秒に1滴）。

注１）Hydroxyapatiteは、リン酸バッファーの濃度依存性で溶出される。

注２）対象により、溶出の際に、凝集し沈殿となる、又は、溶出されなくなることがある。この場合には、基質を加える事で、タンパク質の構造がコンパクトになり、凝集をある程度防ぐことができる。

注３）洗浄行程は、30-125 mM KPiのグラジエントでも良い。
注４）特に、aromataseは疎水性が高く、detergent存在下でも、容易に凝集してカラム上で変性する。これを避ける為には、androstenedioneを加えるが、通常のP450と異なりこれを加えると CO差スペクトルがでなくなる。

原子力発電考3：東電の赤字回避？

 

　東京電力が赤字を回避する為に、柏崎刈羽の原子力発電の再稼働を申請するという。東電は、既に経営破綻し、福島の原発事故被災者の補償と一帯の除染、福島原発の廃炉とその管理等にかかる費用を向こう100年以上に渡って捻出し続ける為のみに生かされている会社である。そのような会社が、原発の再稼働を申請するというのは、経営者の感覚を疑う。

　他の電力会社も懲りもせずに原発の再稼働を願って止まないが、事故は万が一でも起こるからこそ事故である。どのようなプラントであろうと、その設計と管理運営は、商業ベースである限り常に安全に掛かる費用と採算性とのバランスの上にあり、原発の事故の確率を更に一桁下げようとすれば商業ベースでは成り立たなくなる事は明らかである。それでも尚、一桁低い確立で事故は起こりうる。逆に言えば、あくまでも経済的に採算が合う範囲での安全性であり、その範囲において常に一定の確立で事故は起こりうる。

　そして、ひとたび事故が起これば、瞬時にその電力会社は事実上の倒産状態となり、100年かかっても、どのように補償しようとも、汚染した国土が旧に復することはない。電力会社の経営陣は、原子力発電のリスクに対しあまりにも楽観的である。現に事故が起こり、3年を経てもなお汚染水の処理さえも漏洩事故が頻繁に起きているような状況で、安全性を主張する事の無意味さ、説得力の無さを感じないものか。あるいは、そのような危険にも矛盾にも一切目をつぶり、安全だと言いなして、本来の目的さえも見失って尚、己の利益の為に強引に再稼働を果たそうとするような精神の持ち主でなければ、電力会社の経営陣には成れないのか。

　福島の事故を目の当たりにして、想像を絶する大きなリスクを抱えている事を見せつけられながら、電力会社の経営陣は何故原発の再稼働を図るのか。人が作り人が運営するプラントである限り、最低限にまで確率を下げる事に努めるとしても、事故が起こる事は当然である。それに対し明確な根拠も示さずに、専門家が安全だと保証しているから安全だではもはや通るまい。せめて福島の原発で広範囲にまき散らされた放射性化合物に対する有効な処理方法を開発し、仮に事故が起こっても環境に放出された放射性化合物を短時間で処理できる事を実証してみせれば、多少は再稼働にも説得力があるかもしれないが。

　更にいえば、原子力安全規制委員会による安全審査というものは、時の政府の意向によってなんとでも成るものである。危険性を主張する専門家は最初から委員に含めなくとも一般の国民には分かりはしないし、マスコミもまた政府の発表をそのまま垂れ流すのみである。そのようにして、危険性を主張する専門家を排除してきた結果として、原子力発電が各地に建設されてきた実績があり、その延長線上に福島の原発事故と事故に対処する技術の欠如を我々は今見ている。

憲法９６条の改正は権力の集中

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　憲法９６条の改正は、これを許してはならない。また、自民党及び改憲勢力が、両院で３分の２を占めるような事態になることも、不安がある。

　政治家が、権限を集中し、反対勢力を排除して、思うままに法律を作り、更に権限を集中して独裁への道を突き進むのは動物の本能のようなものであり、現時点で阿部氏にその意志がなくとも、衆参両院で自民党と改憲勢力が３分の２を占めるようになれば、必ず憲法９６条の改正と権限の集中を推し進めることは疑い様も無い。

　ヒットラー、ムッソリーニ、スターリン、毛沢東など、主義や方向性、歴史的経緯も異なる政治家ではあるが、権限を集中し、反対派を粛清して、己の意図する方向に突き進んだことに変わりはない。一旦、政治家が自由に法律を作り替える権限を手に入れてしまえば、民主主義も基本的人権もどうにでもなるものである。

　日本が軍隊を持つ事は、それ自体を悪いとは思わないものの、その延長には、自国の利益の為の軍隊の海外派遣がある事は自明の理である。国際社会の要請としても、それが正義であるという事にはならない。アフガニスタンにせよ、イラクにせよ、長い混乱の中で、未だ再建の目処もつかない混迷の極にある。

　同じ敗戦国でありながら、国が２分された経緯から、ドイツには軍隊があり、比較的緩いものの、徴兵制度も存在する。しかし、私が知る当時の大学生達は、全員社会的ボランティアをして徴兵の代わりとしていた。その理由は、国を守るならばともかく、アフガニスタンやイラクに派兵されて戦死したいとは思わないという事で要約できる。阿倍首相や橋下大阪市長は、自分自身が、あるいは自分の子どもが徴兵され、日本の国土を守る為ではなく、イラクに派遣されて戦死する事をイメージ出来ているのだろうか。

大腸菌で発現したタンパク質の精製7：SP Sepharose

　Affinity columnの後で、陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂を組み合わせて精製する事で、通常は結晶化に耐える純度のタンパク質を得ることができる。

　ミクロゾームのP450は、DEAE Sepharoseを素通りするものが多く、大部分のものには前回示した方法が使えるであろう。DEAE-Sepharoseの後は、通常はSP-Sepharoseを用いて最後の精製をする。大部分の肝臓のミクロゾーム型のP450には、SP-Sepharoseを用いることができる。しかし、疎水性が高い膜蛋白質の場合には、SP-Sepharoseは強すぎるため（恐らく樹脂上でのP450密度が高くなりすぎるため）樹脂上で凝集し、沈殿となって溶出する、あるいは、樹脂に吸着して出てこない、などの問題が起こる。

　このような現象が起きた時は、もう一段弱い陽イオン交換樹脂である1）CM-Sepharoseを用いる、2）吸着容量の低いHydroxyapatiteを用いる、3）detergentを増加または変更する、4）基質または阻害剤を加える、などの選択肢がある。3）、4）に関しては、精製後に抜く、置換するなどの具体的方法を予め持っておく必要がある。

　

　ウシP450c21は、ウシの副腎皮質からでも精製できる比較的扱い易いタンパク質であり、SP-Sepharoseで精製する事が可能である。ここでは、一例としてこの精製過程を示す。精製サンプルは、この後、ラマンスペクトルにより解析を行う目的があり、NaCholateの不純物による蛍光を避ける為、detergentを高度に精製されたNaCholateに置き換える操作も加えている。従って、ここで用いるNaCholateは同仁堂の精製NaCholateである。

必要なBuffer:

Buffer I:

20 mM   KPi (7.2)
20%       Glycerol
0.1 mM  DTT
0.1 mM  EDTA
1%          NaCholate
0.1 mM   PMSF

Buffer J:

50 mM   KPi (7.2)
20%       Glycerol
0.1 mM  DTT
0.1 mM  EDTA
1%          NaCholate

樹脂はSP-Sepharose (Fast flow)を内径>2.7 cmのカラムに7-8 cmの高さとなるように、buffer Iで平衡化して詰める。（8 cmの高さとして、bed volume 46 cm³ となり、この約40％、18 mlがvoid volumeとなる。）

１）DEAEからの溶出画分をCentriprep 50 (Millipore)を用いて全体で20-25mlとなるまで濃縮する。50ml の

Falcon tubeに回収する。

２）濃縮したサンプルをbuffer Iで2倍に希釈する。（透析をしても良いが、時間がかかり、経験が少ないと沈殿により多くのタンパク質を失う）

３）希釈したサンプルをカラムにチャージする。この流速は、5-6秒に1滴。

４）Buffer JにNaClが50 (10ml), 100 (10ml), 150 (10ml), 200 (10ml), 250 (15ml), 300 (15ml), 350 (20ml), 400 mM (25ml)となるように加えたものを用意しておく。

５）樹脂表面のぎりぎりまで、タンパク質の溶液を落とし、1-2 ml のBuffer Jを用いて、カラム壁面を洗いながら、タンパク質の溶液を完全にカラムの中に入れる。

６）４）のBufferを順番にカラムに加えて行く。50 mMが大部分カラムに入ったところで、100 mMを加えるようにする。流速は、最初は6秒に1滴、P450が動き始めたら、12秒に1滴とする（バンドが広がる感じがあれば、16秒に1滴程度まで落とす）。ここでは、manual でグラジエントの溶出を用いるが、グラジエントメーカーを用いても差し支えは無い。

７）

P450の場合、色がついているので、目で見て回収するフラクションをその場で決めることができる。回収するフラクションは、集めて、Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unitsを用いて、濃縮、および、bufferの置き換えにより、イオン強度の調節をする。

注１）親水性のタンパク質では、これほどの注意を払って、manual gradientを用いる必要はない。

注２）親水性タンパク質でも、最後の溶出までは、NaCholateは入れておいた方が安全であり、抜きたければ、少ない量をAmicon Ultra-15 Centrifugal Filterで抜けば良い。カラム上でdetergentを抜こうとすると、時として総てのサンプルを失うリスクがある。