大腸菌でタンパク質を発現する法23：発現ベクターの作成1

発現ベクターの作成も、小さなことを知らないと徒に時間を浪費することになる。ここでは、既にcDNAを含むプラスミドを入手できている状態から解説する。

手順としては、

１）PCRによるインサートの合成（N-末はNdeI、仮にC-末はHindIIIとする）。

２）PCR産物（cDNA）をミニゲルから単離精製。

３）精製したcDNAをpUCまたはpBluescript（pBS）に挿入。

４）インサートの入ったpUCまたはpBSをminiprepで単離し、インサートのDNA配列を完全に確認する。

５）インサートをNdeI/HindIIIで切り出し、pETに挿入し、DH5など、T7 RNA polymeraseを持たないホストに導入する。

６）transformantからプラスミドを単離し、NdeI/HindIIIで切って、インサートが切り出されることを確認出来たプラスミドを、発現ベクターとして採用する。

７）この発現ベクターをBL21系のホストに導入し、ポジティブクローンを発現用の大腸菌として、１mlの一夜培養を行う。

８）一夜培養液を用いて、大腸菌でタンパク質を発現する法8に従って、IPTG screeningを行う。この方法により、誘導時のIPTG濃度を決めるというのは、実はもっともらしい嘘である。

９）IPTG screeningにより選択したクローンを用いて発現の実験を行う。誘導時のIPTG濃度は、通常0.5 mMを用いることができる。

次回分からは、上記の手順に従って、発現ベクターの作成について詳細を説明する。