大腸菌で発現したタンパク質の精製8：ヒドロキシアパタイトの例

　大部分の哺乳動物のP450はヒドロキシアパタイトでの精製が可能である。ヒドロキシアパタイトは、DEAE-, CM-Sepharoseなどとは性質が異なるので、これらのカラムの後に使用することができる。相対的に吸着容量が小さいこと、粒径が小さいものが一般的で、樹脂の粒がもろいため壊れ易く、カラムが詰まり易いなど、慣れないと扱いにくい面がある。

　Bio-Radのものが一般的で、最近では、樹脂がくだけ易い性質を改良したセラミック担体のものが普通のようである。

　ここでは、大腸菌で発現したアロマテースを、Ni-agarose、DEAE-Sepharoseで精製した後の、3番目のカラムとして用いる例を示す。

DEAE-Sepharoseで素通りしたaromataseサンプルのbuffer組成：

Buffer E:

90 mM        KPi (7.4)

20%             Glycerol

0.1 mM       DTT

0.1 mM       EDTA

1.0%            NaCholate

1.0%            Tween 20

1.0%            Emulgen 913

Hydroxyapatite column (内径2.7 cm x 5-6 cm)

必要なbuffer:

Buffer F:　

20%            Glycerol

0.1 mM       DTT

0.1 mM       EDTA

1.0%            NaCholate

1.0%            Tween 20

0.1 mM       PMSF

Buffer G:

20 mM        KPi (7.4)

20%             Glycerol

0.1 mM       DTT

0.1 mM       EDTA

1.0%            NaCholate

1.0%            Tween 20

0.1 mM       PMSF

Buffer H:

30 mM        KPi (7.4)

20%             Glycerol

0.1 mM       DTT

0.1 mM       EDTA

1.0%            NaCholate

1.0%            Tween 20

0.1 mM       PMSF

Buffer I:

125 mM      KPi (7.4)

100 mM      NaCl

20%             Glycerol

0.1 mM       DTT

0.1 mM       EDTA

1.0%            NaCholate

1.0%            Tween 20

0.1 mM       PMSF

１）上記DEAE-Sepharoseからの素通り画分を、3 volumeのBuffer Fで希釈する。

２）これを、予めBuffer Gで平衡化したHydroxyapatiteに通す。

３）カラムを10-15 mlのBuffer Gで洗浄する（5-6秒に1滴）。

４）10-15 mlのBufer Hで洗浄する（5-6秒に1滴）。

５）Buffer Iで溶出する（12秒に1滴）。

注１）Hydroxyapatiteは、リン酸バッファーの濃度依存性で溶出される。

注２）対象により、溶出の際に、凝集し沈殿となる、又は、溶出されなくなることがある。この場合には、基質を加える事で、タンパク質の構造がコンパクトになり、凝集をある程度防ぐことができる。

注３）洗浄行程は、30-125 mM KPiのグラジエントでも良い。
注４）特に、aromataseは疎水性が高く、detergent存在下でも、容易に凝集してカラム上で変性する。これを避ける為には、androstenedioneを加えるが、通常のP450と異なりこれを加えると CO差スペクトルがでなくなる。

原子力発電考3：東電の赤字回避？

 

　東京電力が赤字を回避する為に、柏崎刈羽の原子力発電の再稼働を申請するという。東電は、既に経営破綻し、福島の原発事故被災者の補償と一帯の除染、福島原発の廃炉とその管理等にかかる費用を向こう100年以上に渡って捻出し続ける為のみに生かされている会社である。そのような会社が、原発の再稼働を申請するというのは、経営者の感覚を疑う。

　他の電力会社も懲りもせずに原発の再稼働を願って止まないが、事故は万が一でも起こるからこそ事故である。どのようなプラントであろうと、その設計と管理運営は、商業ベースである限り常に安全に掛かる費用と採算性とのバランスの上にあり、原発の事故の確率を更に一桁下げようとすれば商業ベースでは成り立たなくなる事は明らかである。それでも尚、一桁低い確立で事故は起こりうる。逆に言えば、あくまでも経済的に採算が合う範囲での安全性であり、その範囲において常に一定の確立で事故は起こりうる。

　そして、ひとたび事故が起これば、瞬時にその電力会社は事実上の倒産状態となり、100年かかっても、どのように補償しようとも、汚染した国土が旧に復することはない。電力会社の経営陣は、原子力発電のリスクに対しあまりにも楽観的である。現に事故が起こり、3年を経てもなお汚染水の処理さえも漏洩事故が頻繁に起きているような状況で、安全性を主張する事の無意味さ、説得力の無さを感じないものか。あるいは、そのような危険にも矛盾にも一切目をつぶり、安全だと言いなして、本来の目的さえも見失って尚、己の利益の為に強引に再稼働を果たそうとするような精神の持ち主でなければ、電力会社の経営陣には成れないのか。

　福島の事故を目の当たりにして、想像を絶する大きなリスクを抱えている事を見せつけられながら、電力会社の経営陣は何故原発の再稼働を図るのか。人が作り人が運営するプラントである限り、最低限にまで確率を下げる事に努めるとしても、事故が起こる事は当然である。それに対し明確な根拠も示さずに、専門家が安全だと保証しているから安全だではもはや通るまい。せめて福島の原発で広範囲にまき散らされた放射性化合物に対する有効な処理方法を開発し、仮に事故が起こっても環境に放出された放射性化合物を短時間で処理できる事を実証してみせれば、多少は再稼働にも説得力があるかもしれないが。

　更にいえば、原子力安全規制委員会による安全審査というものは、時の政府の意向によってなんとでも成るものである。危険性を主張する専門家は最初から委員に含めなくとも一般の国民には分かりはしないし、マスコミもまた政府の発表をそのまま垂れ流すのみである。そのようにして、危険性を主張する専門家を排除してきた結果として、原子力発電が各地に建設されてきた実績があり、その延長線上に福島の原発事故と事故に対処する技術の欠如を我々は今見ている。

憲法９６条の改正は権力の集中

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　憲法９６条の改正は、これを許してはならない。また、自民党及び改憲勢力が、両院で３分の２を占めるような事態になることも、不安がある。

　政治家が、権限を集中し、反対勢力を排除して、思うままに法律を作り、更に権限を集中して独裁への道を突き進むのは動物の本能のようなものであり、現時点で阿部氏にその意志がなくとも、衆参両院で自民党と改憲勢力が３分の２を占めるようになれば、必ず憲法９６条の改正と権限の集中を推し進めることは疑い様も無い。

　ヒットラー、ムッソリーニ、スターリン、毛沢東など、主義や方向性、歴史的経緯も異なる政治家ではあるが、権限を集中し、反対派を粛清して、己の意図する方向に突き進んだことに変わりはない。一旦、政治家が自由に法律を作り替える権限を手に入れてしまえば、民主主義も基本的人権もどうにでもなるものである。

　日本が軍隊を持つ事は、それ自体を悪いとは思わないものの、その延長には、自国の利益の為の軍隊の海外派遣がある事は自明の理である。国際社会の要請としても、それが正義であるという事にはならない。アフガニスタンにせよ、イラクにせよ、長い混乱の中で、未だ再建の目処もつかない混迷の極にある。

　同じ敗戦国でありながら、国が２分された経緯から、ドイツには軍隊があり、比較的緩いものの、徴兵制度も存在する。しかし、私が知る当時の大学生達は、全員社会的ボランティアをして徴兵の代わりとしていた。その理由は、国を守るならばともかく、アフガニスタンやイラクに派兵されて戦死したいとは思わないという事で要約できる。阿倍首相や橋下大阪市長は、自分自身が、あるいは自分の子どもが徴兵され、日本の国土を守る為ではなく、イラクに派遣されて戦死する事をイメージ出来ているのだろうか。

大腸菌で発現したタンパク質の精製7：SP Sepharose

　Affinity columnの後で、陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂を組み合わせて精製する事で、通常は結晶化に耐える純度のタンパク質を得ることができる。

　ミクロゾームのP450は、DEAE Sepharoseを素通りするものが多く、大部分のものには前回示した方法が使えるであろう。DEAE-Sepharoseの後は、通常はSP-Sepharoseを用いて最後の精製をする。大部分の肝臓のミクロゾーム型のP450には、SP-Sepharoseを用いることができる。しかし、疎水性が高い膜蛋白質の場合には、SP-Sepharoseは強すぎるため（恐らく樹脂上でのP450密度が高くなりすぎるため）樹脂上で凝集し、沈殿となって溶出する、あるいは、樹脂に吸着して出てこない、などの問題が起こる。

　このような現象が起きた時は、もう一段弱い陽イオン交換樹脂である1）CM-Sepharoseを用いる、2）吸着容量の低いHydroxyapatiteを用いる、3）detergentを増加または変更する、4）基質または阻害剤を加える、などの選択肢がある。3）、4）に関しては、精製後に抜く、置換するなどの具体的方法を予め持っておく必要がある。

　

　ウシP450c21は、ウシの副腎皮質からでも精製できる比較的扱い易いタンパク質であり、SP-Sepharoseで精製する事が可能である。ここでは、一例としてこの精製過程を示す。精製サンプルは、この後、ラマンスペクトルにより解析を行う目的があり、NaCholateの不純物による蛍光を避ける為、detergentを高度に精製されたNaCholateに置き換える操作も加えている。従って、ここで用いるNaCholateは同仁堂の精製NaCholateである。

必要なBuffer:

Buffer I:

20 mM   KPi (7.2)
20%       Glycerol
0.1 mM  DTT
0.1 mM  EDTA
1%          NaCholate
0.1 mM   PMSF

Buffer J:

50 mM   KPi (7.2)
20%       Glycerol
0.1 mM  DTT
0.1 mM  EDTA
1%          NaCholate

樹脂はSP-Sepharose (Fast flow)を内径>2.7 cmのカラムに7-8 cmの高さとなるように、buffer Iで平衡化して詰める。（8 cmの高さとして、bed volume 46 cm³ となり、この約40％、18 mlがvoid volumeとなる。）

１）DEAEからの溶出画分をCentriprep 50 (Millipore)を用いて全体で20-25mlとなるまで濃縮する。50ml の

Falcon tubeに回収する。

２）濃縮したサンプルをbuffer Iで2倍に希釈する。（透析をしても良いが、時間がかかり、経験が少ないと沈殿により多くのタンパク質を失う）

３）希釈したサンプルをカラムにチャージする。この流速は、5-6秒に1滴。

４）Buffer JにNaClが50 (10ml), 100 (10ml), 150 (10ml), 200 (10ml), 250 (15ml), 300 (15ml), 350 (20ml), 400 mM (25ml)となるように加えたものを用意しておく。

５）樹脂表面のぎりぎりまで、タンパク質の溶液を落とし、1-2 ml のBuffer Jを用いて、カラム壁面を洗いながら、タンパク質の溶液を完全にカラムの中に入れる。

６）４）のBufferを順番にカラムに加えて行く。50 mMが大部分カラムに入ったところで、100 mMを加えるようにする。流速は、最初は6秒に1滴、P450が動き始めたら、12秒に1滴とする（バンドが広がる感じがあれば、16秒に1滴程度まで落とす）。ここでは、manual でグラジエントの溶出を用いるが、グラジエントメーカーを用いても差し支えは無い。

７）

P450の場合、色がついているので、目で見て回収するフラクションをその場で決めることができる。回収するフラクションは、集めて、Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unitsを用いて、濃縮、および、bufferの置き換えにより、イオン強度の調節をする。

注１）親水性のタンパク質では、これほどの注意を払って、manual gradientを用いる必要はない。

注２）親水性タンパク質でも、最後の溶出までは、NaCholateは入れておいた方が安全であり、抜きたければ、少ない量をAmicon Ultra-15 Centrifugal Filterで抜けば良い。カラム上でdetergentを抜こうとすると、時として総てのサンプルを失うリスクがある。

子宮頸癌の予防ワクチンは接種中止とすべき根拠

　子宮頸癌の90％以上が、ヒトのパピローマウイルス（HPV）の感染により起こると考えられており、日本では2009年から、子宮頸癌の予防の為にHPVワクチンの接種が始まった。

　子宮頸癌は出産適齢期の比較的若い女性に多く、子宮頸癌の摘出手術により、以後妊娠のできない体となる可能性がある。従って、HPVワクチンの集団接種により、HPV感染を予防すれば子宮頸癌も激減し、子宮摘出による不妊の悲劇を無くすことができる。これが、HPVワクチンの接種を推し進めてきた理由であろう。

　ワクチンには、メルク社のガーダシル（Gardasil）とグラクソ・スミスクライン社のサーバリックス（Cervarix）がある。米国のFDAとCDCでは、ワクチン投与により問題が生じると考えられる他の疾患、投薬などが有った患者を除けば、ワクチンにより引き起こされたと判断できる重篤な副作用は明確には認められていないとしている。

　しかし、海外で広く使われており、安全性も確認されているから問題ないとの主張は、危険である。人種が異なれば、様々な遺伝的な違いがあり、日本人での副作用のデーターを考えるべきである。

　日本で起こっている副作用による被害は、ガーダシルによるものか、サーバリックスによるものか、製品のロット番号は特定のものか、ロット番号によらないのか。

2012年の報告によると、

サーバリックス：延べ634万回中869件の副作用の報告（内重篤75件）

ガーダシル：延べ53万回中69件の副作用報告（内重篤7件）

そして、2009年12月の販売開始から継続して副作用の報告があることからすると、メーカー、製品のロットなどの問題ではなく、現在のHPVワクチンの本質的な問題と考えられる。

両者を合わせた重篤な副作用の発生頻度は、82件÷6870000回×100000回＝1.2件となる。つまり、10万回の接種当たり、約1.2人が重篤な副作用に苦しむ。1人3回の接種が必要なので、10万人が接種を受けたとすると、3.6人が重篤な副作用を発症することになる。

ワクチンにより、70％以上のHPV感染は防げるようである。従って、計算上は、70％程度の子宮頸癌を予防できることになる。しかし、使用開始後の年数からすると、ワクチン接種による直接的な子宮頸癌の減少数のデータはまだ無いと考えられる。

また、HPVの感染は、一過性であり、感染しても一生涯有効な免疫は形成されず何度も感染する。では、ワクチン接種による抗体は、どの程度の期間有効であるのか。ワクチンが米国のFDAで承認されたのが2006年なので、ワクチン接種後の抗体の有効期間についても、長期の大規模データは無い。

定期的な子宮癌検診（子宮頸部細胞診）により、扁平上皮癌（子宮頸癌の約75％）は早期発見が可能であり、前がん状態で発見できれば、異常な細胞を除くことで、子宮頸癌となるのを防ぐことができる。少なくとも、定期検診により、前癌状態または早期の子宮頸癌として発見できれば、術後の妊娠、出産も可能である。

国立がん研究センターの統計情報（http://ganjoho.jp/public/statistics/pub/statistics01.html）によると、2011年の女性のがんによる死亡数が多い部位は、多い順に、

大腸＞肺＞胃＞膵臓＞乳房

部位別の死亡数（2011年）では、女性全体で、約14万人ががんで亡くなっている。内、乳癌は約1万3000人、子宮頸癌は2700人。

部位別の死亡率では、１年間（2011年）に人口10万人当たり、がんで亡くなる女性は222.7人、内乳癌は19.7人、子宮頸癌は4.2人。

また、羅漢率（2008年）が多い部位は順に、

乳房＞大腸＞胃＞肺＞子宮（全子宮癌を含む）

2008年に新たにがんと診断された全国推計値は、女性では約31万人、その内、乳癌は約6万人、子宮頸癌は約1万人。

部位別の羅漢率（2008年全国推計）では、1年間に、女性人口10万人当たり468人が新たにがんと診断され、内、乳癌は91人、子宮頸癌は15人。

この数字からすると、HPVワクチンの接種により、うまく行けば全国で年間7000人が子宮頸癌にかかることを予防でき、約2000人が子宮頸癌で死ぬことを防ぐことができる。

　これに対し、ワクチン接種による重篤な副作用と考えられるものが、2012年に、82件、発生頻度は上で計算したように、ワクチン接種10万回当たり1.2人。10万人が3回接種を受けた場合、約3.6人が重篤な副作用を発症する。

　女性人口10万人当たり、15人が子宮頸癌になることを防ぐ為に、大規模なワクチン接種をして、3.6人が重篤な副作用に苦しむのであるとすれば、これは、本末転倒である。

　それ以上に、現在健康な、生涯子宮頸癌にならないかもしれない少女にワクチンを打ち、重篤な副作用によりその人生を破壊してしまうとすれば、厚生省がこれを停止しない理由は無い。まして、ワクチンにより約７割の子宮頸癌が防げるとしても、定期検診により７割以上の前癌状態及び子宮頸癌が発見でき、早期治療が可能であり、早期に発見すれば術後の妊娠出産も可能であることを考えれば、ワクチンによるリスクはそれを受ける利益に見合わない。

　少なくとも、家族にこのワクチン接種を受けさせようとは思わない。

大腸菌で発現したタンパク質の精製6：DEAE Sepharose 使用の具体例

大腸菌で発現したP450c21はNi-NTA agaroseで精製後、DEAE Sepharoseを素通りさせ、それを更にSP Sepharoseで精製する。ここでは、DEAE Sepharoseを素通りさせる過程を具体的に示す。

必要なバッファー：

Buffer E:

20% Glycerol

0.1 mM DTT

0.1 mM EDTA

1.5% NaCholate

1% Tween 20

0.1 mM PMSF

Buffer F:

 20 mM KPi (7.4)

20% Glycerol

0.1 mM DTT

0.1 mM EDTA

1.0% NaCholate

0.1% Tween 20

0.1 mM PMSF

Buffer G:

50 mM KPi (7.4)

20% Glycerol

0.1 mM DTT

0.1 mM EDTA

1% NaCholate

0.5%    Tween 20

0.1 mM PMSF

20 mM imidazole

Buffer H:

60 mM Imidazole-AcO (7.4)

20% Glycerol

0.1 mM DTT

0.1 mM EDTA

1% NaCholate

0.5%    Tween 20

0.1 mM PMSF

樹脂はDEAE Sepharose (Fast flow)を内径2.7 cmのカラムに5-6 cmの高さとなるように、buffer Fで平衡化して詰める。

１）Ni columnからの溶出画分を、同じvolumeのbuffer Eで希釈する。(この段階では、イミダゾールがヘム鉄に配位しているので、うかつに透析でイミダゾールを除くと総て沈殿して発現からやり直すことになる）

２）希釈したP450を含む溶液を樹脂を乱さないようにカラムに加える。この時の流速は5-6秒に1滴とする。総ての溶液を加えて樹脂を素通りさせる。

３）ほぼ総ての溶液が樹脂に吸収され、上部に樹脂の上部に1-2 mmとなった時点で、buffer Gを2-3 mlそっと加え、これが樹脂に吸収するのを待ち、もう一度、2-3 mlのbuffer Gを加えてこれが樹脂に吸収されるのを待ち、10-20 mlのbuffer Gで押し出した後、40 mlのbuffer Hで残りを出し切る。

４）適当なフラクションをピックアップして、CO-スペルトルを測定し、回収する画分を決める。

５）回収したフラクションは、一部電気泳動用に分けておき、総てを液体窒素で凍らせて、-80度で保存する。

注）コール酸はDEAE Sepharoseに吸着する。このために、一部P450は軽くカラムに吸着するが、buffer Hで溶出される。

大腸菌で発現したタンパク質の精製5：樹脂の選択

Ni-NTA agaroseから溶出されたP450は、約90％以上の純度となると考えられる。これをSDS-PAGEでオーバーロード気味にしても単一バンドとなる程度まで精製する為には、DEAE-Sepharose→SP-Sepharoseなど更に精製を進める必要がある。まず、P450の精製を例に具体例を挙げながら説明を進める。

１）DEAE-Sepharoseの利用（陰イオン交換樹脂）

大部分の動物のP450は、低めのイオン強度でも一定条件でDEAE-Sepharoseを素通りする。従って、Ni-NTA agaroseからの溶出画分を、低めのイオン強度でDEAE-Sepharoseに素通りさせることにより、大部分の不純物はDEAE-Sepharoseに吸着して除くことができる。基本的に素通りさせることを考えているので、太く短いカラムで十分であり、操作が楽で、時間も短縮できる。

動物のP450は、疎水性の高い膜蛋白質であり、detergent存在下でも凝集し易いことが精製の際の問題となる。その為に、Q-Sepharoseのような強いイオン交換樹脂は用いない。一方で、細菌のP450など可溶性の蛋白質の場合には、Q-Sepharoseの方が効率が良い場合が多い。しかし、細菌のP450のような可溶性蛋白質を精製する場合でも、必ずコール酸／Tween 20を用いておく方が安全である。

可溶性蛋白質の精製でも必ずコール酸／Tween 20を加えて精製することにより、蛋白質の凝集、カラムの樹脂への吸着を防ぐことができ、精製のトラブルを減らし、回収率を上げることができる。必要ならばdetergentは後で抜くか、置き換えるかすれば良く、精製中にリスクを冒す必要はない。

２）CM-SepharoseまたはSP-Sepharoseの利用（陽イオン交換樹脂）

大部分の動物のP450は、CM-またはSP-Sepharoseに吸着する。これを、3番目のカラムとして用いることにより、P450を高度に精製することができる。これを3番目のカラムとして用いることの理由は、この段階では、精製サンプルは既にほとんど不純物は除かれており、吸着容量としては、P450のタンパク量で必要なカラムの体積（bed volume）を計算できる為、大きなカラムの体積は不要であり、これもまた、太く短めのカラムで、十分に不純物との分離を得ることが可能である。

精製には常にdetergentを用いることは、陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂ともに共通している。もし、SP-Sepharoseを用いて蛋白質が凝集するようであれば、CM-Sepharoseに切り替えるべきである。

３）hydroxyapatite

アロマテース（P450arom）の3番目のカラムとしては、hydroxyapatiteが有効である。多くのP450の精製に使えるが、通常、大腸菌で発現したP450は、N-末端の疎水的な膜に挿入される部分（membrane anchor）を削除しているので、hydroxyapatiteをあえて使用する必要はない。アロマテースの場合には、N-末端を削除してもなお疎水性が高く、カラム上で容易に凝集する為に、hydroxyapatiteのような、比較的吸着能の低いカラムを使用することで、凝集を防ぎ、精製することが可能である。

４）ゲル濾過

P450のゲル濾過は、Sephadex G200などで行うことができる。しかし、これを精製に用いるという考えは妥当ではない。特に、疎水性蛋白質では、ゲル濾過にもdetergentの存在が必要であり、しかもカラム長は長くせざるを得ない。その結果、ゲル濾過での樹脂への蛋白質の吸着が多く、回収率が極端に低下する。また、ゲル濾過を行うには蛋白質を濃縮する必要があり、一方で、溶出してくる蛋白質画分は希釈されてしまう。手間と、時間と、蛋白質のロスを考えれば、ゲル濾過は精製に使用すべきではない。

５）透析

イオン強度を調節する為に、透析により脱塩をすることは常套手段であるが、透析は、手間と時間がかかる一方で、蛋白質の凝集のリスクが大きい為に、私は、通常これを避け、低イオン強度のbufferで希釈する方法をとっている。