大腸菌で発現したタンパク質の精製3：Ni-NTA Agaroseの具体例１

以下に、Ni-NTA agaroseを用いた精製の具体例を示す。

必要なバッファー：

Buffer A:

 50 mM     KPi (7.4)

500 mM    NaAcO

20%        　 Glycerol

0.1 mM 　　　DTT

0.1 mM     EDTA

1.5%         NaCholate

1%            Tween 20

0.1 mM     PMSF

Buffer B:

 50 mM     KPi (7.4)

500 mM    NaAcO

20%          Glycerol

0.1 mM     DTT

0.1 mM     EDTA

1.5%         NaCholate

1%            Tween 20

0.1 mM     PMSF

20 mM      Imidazole (0.136 g/100 ml)

Buffer C:

20 mM      KPi (7.4)

20%          Glycerol

0.1 mM     DTT

0.1 mM     EDTA

1%            NaCholate

0.5%         Tween 20

0.1 mM     PMSF

20 mM      Imidazole

Buffer D:

100 mM   Imidazole-AcO (7.4)

20%         Glycerol

0.1 mM    DTT

0.1 mM    EDTA

1%           NaCholate

0.5%        Tween 20

0.1 mM    PMSF

注１）KPi (7.4)は、500 mMのリン酸バッファーをオートクレーブにより滅菌し、保存したものを使用。

注２）Buffer A, B, Cは、PMSFを除く総てを含む溶液を調整した後に、NaOH水溶液、又は酢酸でpHを7.4に合わせる。（重要）

注３）Buffer Dは、Imidazoleはパクダーで加え、PMSFを除く総てを加えてから、酢酸にてpHを7.4に合わせる。

注４）PMSFは総てのケースで、使用の直前に加える。

操作：

０）　蛋白質は、buffer Aで細胞から抽出したものを使用する。

１）　前日にNi-NTA agaroseを高さ3-4 cmとなるようにカラム（内径3 cmのオープンカラムを使用）に詰め、Buffer Aで平衡化する。

２）　大腸菌抽出液をカラムに通す。流速は、6秒に1滴が落ちる程度。

３）　大腸菌抽出液が総て通り、樹脂の上に2 mm程度を残すのみとなった時、スポイドでbuffer Bを取り、カラム上部の壁を洗うように回しながら、樹脂の上部を乱さないように、buffer Bを樹脂の上5 mm程度になるまで加え、再び、樹脂の上に液が2 mmとなるのを待って、もう一度同じことを繰り返す。この操作で、カラムの壁についた蛋白質を奇麗に洗い流すと同時に、大腸菌抽出液を完全に樹脂の中に通してしまう。その後、樹脂の上部を乱さない様に、buffer Bをカラムの上まで加える。buffer Bが減ってきたら更に追加し、全量で50 mlのbuffer Bでカラムを洗う。

４）　次に、同じ要領で、buffer Cでカラムを洗う。この行程は、イオン強度を落とす目的がある。

５）　buffer Cが樹脂の上2 mm程度になったとき、同様にしてbuffer Dに切り替え、目的の蛋白質を溶出する。溶出の流速は、12秒に1滴くらいまで遅くする。全体で50 ml程度のbuffer Dを用いて、目的蛋白質を完全に溶出する。

６）    溶出した蛋白質は、解析用に少量のサンプルを1.5 mlのチューブに取り、総て液体窒素で凍らせて、-80度で保存し、活性、SDS-PAGEなどで確認した後、プールするフラクションを決める。

注１）２−５までの行程が、１日で終わるように時間調整する。

注２）目的蛋白質が出始めた最初のフラクションは捨てる。

注３）翌日、buffer D 25 mlでカラムを洗った後、buffer Aで平衡化しておくと、そのまま次の精製に使用できる。3回くらいは使用可能で、3回使った後、樹脂は捨てている。樹脂を再生して使用する方法も発表されているが、手間と効率を考えると、勧められない。