発現ベクターを作成する為に最初に入手すべき標的タンパク質のcDNAは、現在では容易に入手できる。真核生物のcDNAは、cDNAライブラリーを入手できれば、ここから増幅するのも欲張らなければ通常は容易である。
cDNAをプラスミドで得ることができたとして、PCRの為に、N-末端とC-末端のプライマーをデザインする必要がある。このプラーマーのデザインにあたっての前提条件を前回記したので、ここでは、具体的なデザインについて考える。
この際の注意点は、ある程度先にも延べているが、
１）ベクターへの挿入にはNdeIサイト（N-末）とC-末は使い易いサイト、例えばHindIIIなどを使用するように考えて、PCR用のオリゴを発注する。
２）N-末端の配列が、後の発現レベルに大きく効いてくる為、N-末のデザインには特に注意が必要である。例えば、以下に示すのはCYP21を発現した際の、N-末のオリゴである。
acgcatatggctaaaaagacatcatctaaaggtaagctcccacctctggtccccggcttcctgc
ここでは、PCRの反応後、PCR精製フラグメントをblunt
end でpBS（pBlueScript）のEcoRVサイトに一旦サブクローニングし、ここで、拾い上げたクローンのインサートが完全である事をsequenceにより確認する。その後、NdeI/HindIIIでフラグメントを切り出し、pETに挿入する。pETではフラグメントがNdeI/HindIIIで切り出せる事だけを確認して、以後の実験に使用する。
5’-末端のacgはPCRを完結させる事、後のベクターへの挿入の際にNdeIサイトが確実に再生されるようにつけている云わば、マージンの残基である。従って、acgでなければならない理由は無いが、cccとかgggとすると、blunt
endでのligationの効率が落ちるので、末端が固い２次構造をとらないように気持ち配慮している。
acgの後catatg(NdeI site)、その後に良く発現する事が知られているRat CYP2C3のN-末端（小文字の部分）で置き換えている。
セカンドコドンは、gctとし、以降の配列はアミノ酸配列を維持したままAT-richの配列とし、RNAが固い2次構造をとらず、リボソームが効率よく移動できることを意図している。
大文字の部分からがCYP21の配列（28
nt）である。従って、全長64
ntのうちcDNAとanealするのは28
ntのみである。経験上、anealする配列が24
nt以上あればPCRの効率に問題は起こらない。安全の為に、ここでは長めに取って28ntとしている。
C-末端は、以下のようにデザインする。見やすいように+鎖で示すと、
左から24ntがcDNAとanealするCYP21の核酸配列であり、その後に、Hisをコードする6個のコドン（CACCATCACCATCACCAT）を導入し、ストップコドンを入れて、HindIII
site、末端のマージンとしてcgtを加える。（当然発注する際は、5’
acgaagctt...と相補鎖を発注する）
1）PCRの反応は、その時に評判の良いproof
readingのDNA
polymeraseを用いて、普通にやれば良い。反応は、0.05mlのスケールで十分である。
2）反応後、Klenow
fragmentを1
micro-L 加えて、37度で1分程おき、PCR
生成物の両末端を完全に埋めてblunt
endとする。（Klenow
fragment処理によって、blunt
ligationの効率が上がる。注1参照）
3）反応液をミニゲルに流し、予定したサイズのfragmentをゲルから切り出す。PCRの反応がうまくいっていれば、目的のfragmentが主生成物としてはっきりとしたバンドになる。
4）この精製は現在ではキットを使うのが良いであろう。私は、キットを使った事が無いので、どれが良いか良く知らないが。
fragmentはethanol沈殿の後、0.5
micro-L の水に溶かす。
一方で、pBS約1
micro-gをEcoRVでdigest（20
micro-L scale)した反応液を、thermo-labile phosphatase（New
England BioLab）で処理し、熱処理後、-20度でストックしておく。（注2）
5）水1micro-Lに溶かしたPCR
fragment のtubeに予め作っておいたpBS
(EcoRV digested)を0.5 micro-L加える。
6) TaKaRa
DNA Ligation Kit Ver 2.1のI液を1.0
micro-L加える。voltexで混ぜ、spin
downした後、16度で1時間程おく。（注3）
注1）PCR fragmentのsubcloningに関しては、非常に多くの検討がなされ、現在ではsubcloning kitを用いるのも一つの選択ではある。
注2）transformationで生えてくるコロニーの数は、ligationに用いるベクターの量によって決まる。従って、EcoRVで切るpBSの量を最初にきちんと決めておけば、生えてくるコロニーの数は常にほぼ一定となるように調節できる。
注3）タカラのligation
kitは非常に優れており、使い勝手も良い。kit一つで、26000円するが、一つのkitにI液が0.75
ml入っており、1.0 micro-Lづつ使うとすれば、750回分、一回当たり35円の計算である。
トランスフォーメイション（Transformation）
competent cellは通常は購入した方が簡単である。タカラのDH5
competent cell は1 mlで約2万円であるが、1回10
micro-Lあれば、subcloningには十分である。10
micro-Lとすれば、一回当たり約200円で、確実にモノが得られれば特に節約して自分で作る程の事も無い。
もし、competent
cellを自分で作ろうという事であれば、以下の方法が簡便であり、経験の少ない学生でも失敗が無い。
Inoue H, Nojima H, Okayama H (1990) High efficiency
transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene.
96, 23-28.
Blue-White selectionによりwhite
コロニーをピックアップする。（発現する方法8で示したようにピックアップしたくローンはナンバーをつけてストリークして保存する。）
ポジティブクローンを6個取り、プラスミドのmini-prepを行う。私はこのステップでは多少変わったやり方をとる。
1）この培養は1.5
ml TBで行い、kitを使わずクラシカルなSDS-NaOH法でmini-prepを行う。最終のプラスミドは50
micro-Lに溶かす。（注4）
2）1
micro-Lを取り、10
micro-L scaleでNdeI/HindIII digestionを行い、ミニゲルでfragmentが切り出される事を確認する。
3）fragmentが切り出されたもの2サンプルを選び、それぞれ20
micro-Lをmini-prep
kitにより精製し、これを用いて両側からsequencingして、核酸配列が完全に正しいことを確認する。（注5）
4）正しいものいずれか一つを選び、50
micro-LのscaleでNdeI/HindIII
digestionを行い、fragmentをミニゲルから切り出して、上記のsubcloningと同様の方法で、pET17
(NdeI/HindIII digested)に導入し、DH5に入れる。（注6）
5）ポジティブクローンを４個程度拾い、plasmid
mini-prepの後、NdeI/HindIII
digestionによりfragmentがでるものを一つ選びこれを最終的な発現用のプラスミドとする。
6）このプラスミドを再度BL21系のホストに入れ、発現実験を開始する。
注4）古い方法で行う理由は、一回のprepで十分な量を確保する事である。通常の1
mlのLB培養を用いるkitではplasmidが十分確保できないことがある。
注5）sequencingの為には、キットでの精製が不可欠であり、一方で、アメリカ製のkitは不良品の為に全くplasmidが取れないことがあり、kitの利用は最小限としている。
注6）pETのplasmidが欲しい時には、DH5に導入する。ここでBL21系のホストを用いると、恐らく、T7
RNA polymeraseの転写のリークの為と考えているが、極端にプラスミドが取れないことがある。
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