プラスミド ミニプレップ（Plasmid mini-preparation）：初心者の為のプロトコール

　プラスミドのミニプレップは、様々なキットがあり、誰でも簡単に純度の高いプラスミドを得ることができる。とはいえ、貧乏な研究室では結構な負担ではあるので、目的により使い分けるのが妥当かと思う。例えば、動物などの培養細胞へのtransfectionに用いる場合には、ある程度以上の量を確保したいので、CsClによる超遠心法を用いている。また、sequencerにかけるには以下で延べるSDS-NaOH法により精製したプラスミドの一部をQiagenのQIAprep Spin Miniprep Kit (50)を用いて更に精製してsequence labに出す。

以下に示すのは、比較的簡単にできるだけ多くのプラスミドを得る方法である。この方法の利点は、

１）14 mlのFalconのポリプロのチューブを3 ml TBでのovernight-cultureのculture tubeとして用い、培養後、蓋を取ってそのまま遠心チューブとして使い、最初の大腸菌ペレットの可溶化／中和を同じチューブ内で行う。これにより、培養液を1.5 mlのチューブに移す手間が省ける。

２）3 mlの培養液を処理できるので、1.5 mlチューブ2本分のプラスミドを得ることができる。

３）LBではなくTBを用いるので、大腸菌のペレットを多く処理でき、その分回収されるplasmidの量も多い。
注）欲張って3 ml以上の培養液を処理しようとすると、下記のステップ７の上澄みの処理が、1.5 ml チューブ1本では間に合わなくなる。従って、この方法では、3 mlのTBの一夜培養液を処理するのが上限である。

Equipment and tools:

Low speed centrifuge (Sorvall or Beckman)

Microcentrifuge

14 ml round bottom polypropylene culture tube (Falcon)

1.5 ml tube

Solutions:

Lysozyme bf.

        25 mM   Tris-HCl (pH8.0)

        10 mM   EDTA

        50 mM   Glucose

SDS-NaOH sol. 50ml (Maybe stored at -20 °C)

        0.5 g        SDS

        0.4 g        NaOH

3 M KAcO (pH5.2) (refer to Molecular Cloning) 250 ml

        KAcO (MW. 98.15)          73.6 g

        Acetic acid                         28.75 ml

Phenol/chloroform

        25 ml Phenol (water saturated)

        24 ml Chloroform

          1  ml isoamyl alcohol

20% PEG/2.5 M NaCl (PEG 8000)

7.8 M             NH₄AcO

10 mg/ml        DNase-free RNase A (heat-treated. Refer "Molecular Cloning")

1.      O/N culture in 3 ml TB (use 14 ml round bottom tube).

2.      Spin down (7,000 rpm, 1 min, Sorval). (Note 1)

3.     Vortex bacterial pellets in 0.2 ml Lysis bf. (10 mg/ml lysozyme). Suspend the pellet completely.

4.      Incubate at room temp for 1 min.

5.    Add 0.4 ml SDS-NaOH sol, gently mix until E. coli is lysed, and place on ice. (Solution will be clear yellow and viscous.) (Note 2)

6.      Add 0.3 ml 3M KAcO (pH5.2), gently mix and keep it on ice for 1-2 min. (Yellow and viscous solution will disappear.) (Note 3)

7.      Spin down (7,500 rpm, 10 min) at 4 ^oC and transfer supernatant into a 1.5 ml new tube. (Note 4)

8.      Add 0.6 ml phenol/chloroform, vortex, spin 10 min and transfer the upper phase into a new tube. (Note 5)

9.       Fill up the tube with isopropanol (0.6 ml) and mix. (Note 6)

10.     Spin (10,000 g, 10 min, maximum of microcentrifuge), and discard sup. (Note 7)

11.    Wash the pellets with 1 ml of 75% EtOH, spin, and remove the sol completely by pipetting. (Note 7, 8)

12.     Dissolve pellet in 0.1 ml water containing 0.1 mg/ml DNase-free RNase A.

13.     Incubate at 37 ^oC for 5 min.

14.     Add 0.06 ml PEG/NaCl sol and incubate on ice for 15 min. In most case, you will see white stuffs (plasmid DNA) at this step.

15.     Spin for 10 min (10,000 g). Discard sup and wash the pellets with 75% EtOH. (Note 7, 8)

16.     Dissolve pellets in 0.05 ml water. (The quality of plasmids will be good enough for the most purpose. 0.001 ml for digestion to check inserts on a mini-gel.)

          This protocol yields 0.04-0.05 mg plasmid for pBlueScrip.

Option) For the digestion by restriction enzymes that require the low salt buffer:

17.    Add 0.025 ml (a half volume of 0.050 ml) 7.5 M NH₄AcO (final 2.5 M), mix, and spin at 10,000 g for 10 min and transfer sup into a new tube.

18.    Add 0.15 ml EtOH and spin at 10,000 g for 10 min.

19.    Wash the pellets with 75% EtOH and remove a trace of EtOH by pipette.

20.    Dissolve the pellets in 0.05 ml water.

Note 1) Remove caps of the culture tubes before centrifugation. You may need to use the adaptor for 14 ml tubes. When you spin at a higher speed, rubber adapters with centrifuge tubes may be crashed.

Note 2) When you add SDS-NaOH solution, mix the solution by spinning the tube with your hands with a little angle one by one until the solution become clear yellow without any dusty portion.

Note 3) Similarly, mix the solution by spinning the tube with your hands one by one until the clear yellow portion completely become white junk in nonviscous solution.

Note 4) A small amount of junk can be transferred with the sup. It does not cause any problem.

Note 5) 0.6 ml Phenol/CHCl₃ is a standard volume to fill the 1.5 ml tube. Therefore, you may adjust the volume to 1.5 ml by the phenol/chloroform. Take sup by pipetting but do not take the white junks.  

Note 6) 0.6 vol of isopropanol should be enough. Usually, DNA solution at this step is less than 0.9 ml.

Note 7) Remove the solution by pipetting to ensure the removal of salt.

Note 8) 75-80 % ethanol solution is used for wash away the residual salt.